HPLC 및 LC-MS 버퍼 선택 가이드 상세 정리

1. 서론 및 개요

이 가이드는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)와 LC-MS(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry)에서 버퍼 선택과 pH 조절의 중요성을 다룹니다1. 이온화 가능한 화합물이 포함된 샘플을 분석할 때, 이동상의 pH는 역상 HPLC에서 retention을 제어하는 가장 중요한 변수 중 하나입니다. 대부분의 화합물들이 하나 이상의 산성 또는 염기성 작용기를 포함하고 있기 때문에, 대부분의 이동상은 pH 조절이 필요하며, 이를 위해 버퍼가 널리 사용됩니다.

2. pH 조절이 필요한 이유 (Why Control pH?)

2.1 이온화와 retention의 관계

• 산이 pKa보다 2 pH 단위 이상 높거나 낮을 때, 99% 이상 이온화되거나 비이온화됩니다.
• 염기는 pKa 아래에서 이온화되고 pKa 위에서 비이온화됩니다.
• 비이온화 형태는 더 소수성(친유성)이므로 역상 시스템에서 더 강하게 retention됩니다.
• 낮은 pH에서는 산이 더 강하게 retention되고, 높은 pH에서는 염기가 더 강하게 retention됩니다.

2.2 pH 민감도의 문제점

• 이동상 pH가 pKa 근처일 때, pH의 작은 변화가 retention에 큰 변화를 일으킵니다.
• 단 0.1 pH 단위 변화로도 resolution이 2배 변할 수 있습니다.
• 이는 많은 실험실에서 흔히 발생하는 pH 조정 오차 범위입니다.

2.3 컬럼 안정성 고려사항

• 실리카 기반 컬럼은 일반적으로 2<pH<8 범위에서 작동해야 합니다.
• pH<2에서는 결합상 손실(hydrolysis)이 발생할 수 있습니다.
• pH>8에서는 실리카 백본이 점점 더 용해됩니다.
• 고순도 실리카는 저순도 제품보다 높은 pH를 더 잘 견딥니다.

2.4 실라놀 그룹의 영향

• 구형(Type-A) 실리카의 경우 실라놀 그룹의 pKa가 pH 4-5 영역에 있습니다.
• pH>6에서 상당한 실라놀 이온화가 발생할 수 있습니다.
• 새로운 고순도(Type-B) 실리카는 pKa>7로, 양이온 교환으로 인한 피크 테일링이 최소화됩니다.

3. 실용적 고려사항 (Practical Implications)

3.1 방법 개발 권장사항

• 컬럼과 샘플의 특성을 고려하여 pH 2-3 범위에서 방법 개발을 시작하는 것이 권장됩니다.
• 이 pH에서 대부분의 유기산의 이온화가 억제되고, 컬럼의 실라놀 그룹 이온화도 억제됩니다.
• 염기는 이온화되지만, 대부분 염기성 화합물의 pKa>7이므로 충분히 높은 pH로 조작하면 컬럼에 해로울 수 있습니다.

3.2 pH 조정 전략

• 낮은 pH 이온 억제가 만족스러운 결과를 제공하지 않으면 이동상 pH를 조정할 수 있습니다.
• 일반적으로 중성 및 비이온화 화합물의 적절한 retention을 위해 유기 용매 함량(%B-용매)을 먼저 조정합니다.
• 그 다음 이온성 분석물의 retention을 세밀하게 조정하기 위해 pH를 조정합니다.

4. pH 조절 방법 (Controlling pH)

4.1 버퍼의 필요성

이온화 가능한 화합물의 retention이 이동상 pH에 매우 민감하므로, 버퍼를 첨가하여 이동상의 pH를 조절해야 합니다.

버퍼는 소량의 산이나 염기가 첨가될 때 pH를 유지합니다.

4.2 일반적인 버퍼 물질

HPLC에서 사용되는 다양한 버퍼링 물질들의 pKa 값들:

• 트리플루오로아세트산 (TFA): 0.3
• 인산 (pK1): 2.15
• 구연산 (pK1): 3.13
• 개미산: 3.75
• 아세트산: 4.76
• 인산 (pK2): 7.20
• 트리스: 8.06
• 암모니아: 9.25
• 인산 (pK3): 12.33

4.3 효과적인 버퍼링 범위

• 버퍼는 pKa의 ±1 pH 단위 내에서 가장 효과적입니다.
• pKa로부터 ±2 pH 단위까지는 적절한 버퍼링을 제공할 수 있습니다.

4.4 UV 검출용 인기 버퍼

인산염과 아세트산염이 UV 검출 HPLC에서 가장 인기 있는 버퍼입니다.

• 220nm 이하 파장에서 사용 가능합니다.
• 인산염은 세 개의 pKa 값으로 세 개의 버퍼링 범위를 제공합니다.
  • 1.1<pH<3.1 (실제로는 2.0<pH<3.1)
  • 6.2<pH<8.2
  • 11.3<pH<13.3 (컬럼 안정성으로 인해 제외)

4.5 버퍼링 간격 해결

• 인산염의 pH 3.1과 6.2 사이에는 버퍼링 간격이 있습니다.
• 아세트산염이 3.8<pH<5.8 범위에서 이 간격을 잘 메웁니다.
• 인산염과 아세트산염을 약간 확장하여 2<pH<8 전체 범위를 커버할 수 있습니다.

4.6 구연산염 버퍼

• 세 개의 겹치는 pKa 값으로 2.1<pH<6.4 범위에서 버퍼링 가능합니다.
• 아세트산염과 인산염만큼 낮은 UV 컷오프를 갖지 않습니다.
• 체크 밸브 문제가 더 많이 발생할 수 있어 보통 두 번째 선택입니다.

5. LC-MS용 버퍼 (What about LC-MS?)

5.1 휘발성 요구사항

LC-MS에서는 이동상이 휘발성이어야 하므로, LC-MS 인터페이스의 기능 중 하나가 이동상을 기화시키는 것입니다.

따라서 LC-UV 작업에서 가장 인기 있는 버퍼인 인산염을 사용할 수 없습니다.

5.2 LC-MS 호환 버퍼들

• 암모늄 아세트산염: LC-MS 사용에 충분히 휘발성이지만 2.0<pH<3.8과 5.8<pH<8.0 범위만 커버
• 암모늄 포르메이트 (2.7<pH<3.7): 낮은 pH 끝의 간격을 상당히 잘 메웁니다.
• 암모늄 중탄산염 (6.6<pH<8.6): 높은 pH 값에서 작동합니다.
• 붕산염 (8.3-10.3): 높은 pH용.

5.3 버퍼링 범위의 한계

이들은 원하는 버퍼링 범위를 완전히 커버하지는 않지만, LC-MS 응용에서 사용할 수 있는 것들입니다.

6. 특정 pH 조건

6.1 낮은 pH만 필요한 경우

• 0.1% v/v 인산: LC-UV 응용에서 pH 2에서 합리적인 버퍼링 제공.
• 0.1% v/v 트리플루오로아세트산 (TFA): pH ≈2 생성, 이온 페어링 시약으로도 작용.
• 0.1% 개미산 (pH ≈2.7): LC-MS에서 낮은 pH용 첫 번째 선택.

6.2 TFA의 장단점

• 단백질과 펩타이드 분리에 널리 사용됩니다.
• LC-MS 인터페이스에서 이온화를 억제하여 신호 감소를 일으킬 수 있어 최근 몇 년간 인기가 떨어졌습니다.

6.3 높은 pH 조건

• pH>8은 일반적으로 권장되지 않습니다 (실리카 용해도 증가).
• 필요한 경우 높은 pH용으로 설계된 컬럼을 선택해야 합니다.
• 고순도 실리카, 높은 "carbon load", endcapping이 실리카 용해도를 감소시킵니다.
• 인산염 버퍼는 높은 pH에서 실리카 용해를 촉진하므로 피해야 합니다.
• 대신 피롤리딘과 같은 유기 버퍼를 사용합니다.

7. 버퍼 농도 (How Much?)

7.1 분석물 버퍼링 요구량

• 분석 작업에서 대부분의 샘플이 µg/mL에서 ng/mL 범위입니다.
• <100µL 주입의 경우, 컬럼의 질량은 최대 수백 나노그램입니다.
• 버퍼의 pKa에서 1 pH 단위 떨어진 곳에서도 샘플에 필요한 모든 버퍼링을 제공하기 위해 매우 적은 버퍼가 필요합니다.

7.2 컬럼 버퍼링 요구량

• 상당한 양의 버퍼링된 이동상이 컬럼을 통과하므로 정지상이 지속적으로 버퍼에 노출됩니다.
• 새로운 고순도 실리카 컬럼은 산성 실라놀 그룹이 적어 오래된 저순도 실리카 컬럼보다 적은 버퍼가 필요합니다.

7.3 권장 농도

안전 인자로서 최소 요구량보다 많이 사용하는 것이 좋습니다.

• 산 첨가제: 약 0.1% v/v 범위
• 버퍼: 최종 용액에서 최소 5-10 mM

7.4 샘플 버퍼링의 중요성

이동상 버퍼의 가장 중요한 역할은 주입될 때 샘플을 버퍼링하여 이동상 pH에 빠르게 도달하도록 하는 것입니다.

이동상과 같은 pH의 주입 용매에 소량 샘플을 주입하는 것이 이동상과 pH가 크게 다른 주입 용액에 대량 샘플을 주입하는 것보다 이동상 버퍼의 작업을 훨씬 쉽게 만듭니다.

8. 용해도 문제 (Solubility Issues)

8.1 버퍼 침전의 위험성

• HPLC 펌프에서 버퍼가 침전되면 청소하기 어렵고 부품 교체가 필요할 수 있습니다.
• 컬럼 내부에서 버퍼가 침전되면 정지상의 기공에서 침전된 버퍼를 씻어내는 것이 거의 불가능하므로 컬럼을 폐기해야 합니다.

8.2 유기 용매별 용해도 차이

아세토니트릴(ACN)은 메탄올(MeOH)보다 버퍼와 염에 대해 훨씬 더 나쁜 용매이고, 테트라하이드로퓨란(THF)은 더욱 나쁩니다.

칼륨 인산염, pH 7.0의 용해도 데이터:

• 80% 유기 용매에서: MeOH 15mM, ACN 5mM, THF <5mM
• 50% 유기 용매에서: MeOH >50mM, ACN >50mM, THF 25mM

8.3 온라인 혼합의 문제점

• 고압 혼합 또는 저압 혼합 HPLC 시스템에서 A- 및 B-용매가 믹서에서 전체 농도로 직접 접촉합니다1.

예: 60% ACN에서 10mM 버퍼가 필요한 경우, A-저장소에 25mM 버퍼, B-저장소에 100% ACN을 넣으면 믹서에서 25mM 버퍼가 100% ACN과 접촉할 때 침전이 발생할 수 있습니다.

8.4 염의 선택에 따른 용해도 차이

• 암모늄염이 동일한 조건에서 칼륨염보다 ACN에서 훨씬 더 용해됩니다.
• 아세트산염이 인산염보다 훨씬 더 용해됩니다.
• 일반적으로 용해도 차이로 인해 나트륨염보다 칼륨염을 사용하는 것이 좋습니다.

9. 희석 효과 (Dilution Effects)

9.1 이동상 조제 방법들

이동상 조제에는 여러 가지 방법이 있습니다.

1. 수동 혼합: 단일 저장소에서 이동상을 펌핑
2. HPLC 시스템 블렌딩: 농축 버퍼를 순수 유기 용매와 혼합
3. 희석 버퍼 블렌딩: 희석된 버퍼를 동일한 농도의 버퍼가 포함된 유기 용매와 블렌딩

9.2 각 방법의 장단점

• 수동 혼합: HPLC 시스템에서 버퍼 침전이 가장 발생하기 어려움 (명확성 관찰 및 사전 여과 가능)
• 온라인 혼합: 등용매 방법 개발에 더 편리하고 gradient elution에 필요.

9.3 희석 문제 해결 방안

농축 버퍼와 순수 유기 용매를 혼합하는 대신, 동일한 농도의 버퍼를 포함한 A- 및 B-용매를 사용하는 방법.

• gradient 동안 버퍼 농도가 일정하게 유지됩니다
• gradient 동안 버퍼 희석이 문제가 되지 않습니다
• HPLC 내에서 버퍼 침전 가능성을 피할 수 있습니다

10. 버퍼 준비 (Buffer Preparation)

10.1 네 가지 일반적인 기법

10.1.1 무게 측정법 (가장 권장)

• 레시피에 따라 버퍼 성분을 무게로 측정하고 물로 원하는 부피까지 희석.
• 원하는 농도와 pH의 버퍼를 제공합니다.
• 더 정확하고, 보통 더 빠르며, 시간과 실험실 간에 재현하기 쉽습니다.
• 조제 후 pH를 확인하여 실수가 없었는지 확인하는 것이 좋습니다.

10.1.2 등몰 블렌딩법

• 산성 및 염기성 버퍼 성분의 별도 용액을 만들어 블렌딩.
• 원하는 농도의 버퍼와 pH 미터로 읽을 수 있는 만큼 가까운 pH 제공.

10.1.3 적정법

• 한 성분을 원하는 농도로 만들고 농축산으로 적정.
• 등몰 블렌드보다 농도가 높지만 목표 pH는 정확합니다.

10.1.4 부적절한 방법 (피해야 함)

• 유기 용매 첨가 후 pH 조정.
• 유기 용매가 있을 때의 pH 판독값은 수용액 pH 측정값과 직접 비교할 수 없습니다.
• 다른 인자들(%유기물, 온도)에 더 민감합니다.

10.2 문서화의 중요성

일부 방법은 미묘한 차이에 민감할 수 있으므로, 방법 문서에 버퍼 준비 기법에 대한 설명을 포함하는 것이 중요합니다.

11. 주의사항 (Precautions)

11.1 시약 품질

• 가능한 최고 품질의 시약 사용 - 대부분의 버퍼 성분이 HPLC 등급으로 제공됩니다.
• 버퍼 순도는 등용매 분리보다 gradient elution 분리에서 더 중요합니다.
• 일부 시약 관련 문제는 검출 한계가 낮아질수록 더 문제가 됩니다.

11.2 pH 프로브 오염 방지

• 최대 감도 분석, 특히 <220nm UV 파장에서는 벌크 이동상과 pH 프로브의 접촉을 피하는 것이 좋습니다.
• pH 확인을 위해 이동상의 일부를 제거하여 pH를 확인한 후 해당 일부를 폐기하는 절차를 사용합니다.

11.3 여과

버퍼를 준비한 후 항상 여과해야 합니다:

• 화학적으로 순수할 수 있지만 먼지, 마모된 버퍼 병 캡 라이너의 미립자 물질, 또는 염의 침전이 있을 수 있습니다.
• 사용 전에 0.5µm 기공도 필터를 통해 여과하는 것이 좋습니다.

11.4 미생물 성장 방지

• 버퍼는 미생물에게 좋은 영양원입니다.
• 저장소를 다시 채우지 말고 세척합니다.
• 사용하지 않은 버퍼 폐기를 위한 합리적인 만료일을 설정합니다.
• 많은 실험실에서 희석 버퍼(<50mM)에 대해 1주일 만료일을 지정합니다.

11.5 휘발성 버퍼 관리

• LC-MS용 휘발성 버퍼(예: 암모늄 중탄산염)는 증발 손실로 인해 시간이 지남에 따라 pH가 변할 가능성이 높습니다.
• 이러한 버퍼는 매일 만드는 것이 좋습니다.

11.6 시스템 종료 시 주의사항

• 연장된 시간(몇 시간 이상) 동안 HPLC 시스템을 종료할 때는 버퍼를 씻어내지 않고 두지 않는 것이 좋습니다.
• 사용하지 않는 HPLC 시스템에 버퍼를 남겨두면 펌프나 다른 구성 요소 내에서 버퍼 침전이나 미생물 성장이 발생할 수 있습니다.
• 물/유기 이동상으로 전환하고 시스템을 통해 10-20mL 플러시하여 강용매 플러시 전에 버퍼를 제거합니다.

11.7 역상 컬럼의 특별 고려사항

• 역상 컬럼에서 100% 물로 플러시하는 것은 버퍼 제거에 효과적이지 않습니다.
• 많은 정지상이 100% 물과 함께 dewetting(상 붕괴)을 겪어 세척 과정이 무효가 됩니다.
• "고수성" 또는 "AQ" 타입 상은 dewetting 우려 없이 100% 물로 플러시할 수 있습니다.

12. 요약 (Summary)

12.1 버퍼 사용의 목적

• RP-HPLC 분리에서 이온화 가능한 화합물의 retention을 제어하기 위해 버퍼가 사용됩니다.
• 일반적으로 샘플 retention을 최대화하기 위해 분석물의 이온화를 억제하려고 합니다.
• 이는 이동상 pH가 산의 경우 샘플 pKa보다 최소 2 pH 단위 아래, 염기의 경우 2 pH 단위 위에 있어야 함을 의미합니다.

12.2 효과적인 버퍼링

• 가장 효과적인 버퍼링을 위해서는 버퍼의 pKa ±1 pH 단위 내에서 버퍼를 사용해야 합니다.
• 샘플과 버퍼의 이러한 특성은 버퍼 선택을 신중히 해야 함을 의미합니다.

12.3 LC-UV 및 LC-MS용 버퍼 선택

• LC-UV 분석의 경우: 인산염과 아세트산염 버퍼가 가장 인기 있으며, 아세트산염-인산염 조합으로 2<pH<8 범위를 커버할 수 있습니다.
• LC-MS 응용의 경우: 버퍼가 휘발성이어야 하므로 선택이 더 제한적입니다. 포르메이트, 아세트산염, 암모니아, 중탄산염의 다양한 조합이 가장 인기 있습니다.

12.4 저pH 조건

• 많은 LC-UV 및 LC-MS 방법에서 실제 버퍼의 존재보다 낮은 pH가 더 중요합니다.
• 이 요구사항을 만족하기 위해 0.1% 인산(UV) 또는 개미산(MS)을 사용할 수 있습니다.

12.5 적절한 버퍼 농도

• 현재 고순도 컬럼의 낮은 실라놀 활성과 낮은 분석물 분자 농도는 최종 이동상에서 5-10mM의 버퍼가 대부분의 응용에 만족스럽다는 것을 의미합니다.

12.6 침전 방지

• A-저장소에 버퍼를, B-저장소에 유기 용매를 넣어 이동상을 블렌딩하는 경우, 버퍼와 유기 용매가 블렌딩될 때 침전을 피하기 위해 버퍼 농도를 ≈25mM 미만으로 유지하는 것이 좋습니다.

12.7 일반적인 주의사항

• 오염물질을 피하고, 준비 후 버퍼를 여과하며, 사용하지 않을 때는 시스템에 버퍼를 남겨두지 않도록 주의해야 합니다.

이 가이드는 HPLC 및 LC-MS에서 효과적이고 안전한 버퍼 사용을 위한 포괄적인 지침을 제공하며, 실용적인 방법 개발과 문제 해결에 도움이 되는 상세한 정보를 담고 있습니다.